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GDS-80基因枪向苹果幼苗中导入载体取得更高转化效率

作者: 编辑 来源:互联网 发布时间:2021-02-18

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  遗传转化通常是以接种的叶盘在固体培养基上诱导愈伤组织和脱分化为基础的。建立这样一个复杂系统的过程需要大量的人力和时间。 如果一个品种成功转化,其他品种可能不能用相同的方法转化。此外,即使培育出一个优秀的转基因品种,我们应用的机会也很小。在过去的儿十年里,模式植物的分子生物学研究取得了令人瞩目的进展。然而,在与人类休戚相关的农作物、果树等经济类植物中,分子水平上的研究却远远落后,无法满足人们对其改良育种的需要。这其中一个重要的原因就是,迄今为止,转基因、基因突变等分子生物学常规操作在大多数植物中依然存在技术瓶颈,需要我们逐一去突破。

  可喜的是,近些年快速发展起来的一种被称为病毒诱导的基因沉默技术有望使这一局面得以改观。 病毒诱导的基因沉默(Virus-induced gene silencing,VIGS)在植物的基因功能鉴定中是一个非常有用的工具,与传统的研究植物基因功能的方法相比,具有简使高效、周期性短、不需要对植物进行转化,以及可以沉默基因家族等特点,并且可以在物种间和物种内不同遗传背景的植物间进行基因功能的比较。而且,尽管VIGS没有通过稳定的植物转化过程,人们近年来发现其沉默效应也能够传递给后代,这预示着该技术有望在作物改良上发挥巨大的潜力,应用前景十分广阔。

  但是自VIGS技术发明以来,VIGS载体的应用一直是依赖于植物种的。 直到采用Barley stripe mosaic virus(BSMV)载体沉默大麦(Hordeum wulgare)基因的报道出现,VIGS用于单子叶植物功能基因组的研究才开始起步。近年来,众多新载体尤其是通用载体的研发,不断地拓展VIGS的应用范围。目前,应用最广泛的VIGS载体,有Apple latent spherical virus(ALSV)、Barley stripe mosaic virus(BS-MV)以及Tobacco rattle virus(TRV)等。

  苹果潜伏球形病毒(ALSV)是一种通过病毒诱导作物转录基因沉默(VITGS)实现病毒诱导基因沉默(VIGS)、基因表达和表观遗传育种的有效系统。 ALSV不一定能感染所有植物,但它能感染多种作物,如苹果、梨、樱桃、大豆、豌豆、黄瓜、西瓜、矮牵牛、桔梗和日本龙胆,感染率相对较高。ALSV载体制备和感染的方案在不同出版物之间有所不同,目前仍通过新的实验条件试验得到改进,以提高感染率并避免插入序列的缺失。 目前看来,最有代表性的方法实际实验顺序是,载体制备、对本氏烟草进行农杆菌侵染、在藜麦中繁殖、病毒颗粒和病毒RNA的提取、最终让病毒侵染目标植物(例如苹果) 和日本龙胆。

  为了让病毒更有效地侵染目标植物,实验人员常通过刮伤植物并涂抹病毒溶液的方式增加侵染效率,但这种方式需要耗费大量的人力和时间,于是越来越多的实验室开始选择用基因枪轰击的方式提高病毒侵染效率。

  Springer在2017年出版的著作《Plant Epigenetics》(植物表观遗传学)收录了日本岩手大学农学部植物病理学研究室的文章《Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops》(苹果潜伏球形病毒(ALSV)载体用于多种作物的反向遗传研究和非转基因育种)。文章中介绍ALSV载体的特性,以及载体制备和用载体RNA接种植物的实用方案,并给出了用ALSV载体实现VIGS和VITGS的例子。载体RNA接种植物时,实验室采用了近期引进的GDS-80基因枪系统,并指出相比其他基因枪系统,操作更简单,ALSV感染率较高,同时该系统的使用也没有商业授权使用限制。

  实验中,每次轰击粒子均使用5 ug病毒RNA和0.4 mg金颗粒。文章中介绍了40次轰击的准备工作,根据实验规模调整RNA和金颗粒的量。在1.5 mL塑料管中称出16 mg的金颗粒(0.6 um直径)。加入50 uL无菌蒸馏水并涡旋振荡。超声处理1分钟。涡旋混合管。将RNA溶液(200 ug RNA,通常为50 uL)一点一点地加入涡旋溶液中。加入10 uL(1/10体积)乙酸铵(5 M)。加入220 uL(两倍体积)的异丙醇。在-20℃放置1小时。涂有病毒RNA的金颗粒将沉入溶液底部。用移液器除去上清液。涡流一秒钟。用1mL 100%乙醇(用分子筛脱水)洗涤金颗粒四次。将金颗粒溶于400 uL的100%乙醇(用分子筛脱水)中。超声处理一秒钟以分散。

  轰击之前必须稳定植物样品:否则植物会被打散并受伤。发芽后立即将苹果幼苗绑在柔软的铝网之间,用海绵和铜网将龙胆幼苗固定,龙胆幼苗在硬纸板上轰击,以防止土壤颗粒散布到周围。向枪管中注入10 uL金颗粒溶液。近距离(1-3厘米)轰击金颗粒。金颗粒在表面可见为棕色污点。完成所有轰击后,关闭氦气瓶阀,并通过反复射击来除去管内的气体。关闭减压阀,拆下气管,然后在水中超声处理30分钟,以洗涤枪管。

  VIGS技术应用于植物研究,在很多方面优于其它的基因阻断方法,这些优势可能还会超出我们的想象。 现阶段的VIGS已经能够直接应用于部分农作物,如马铃薯、番茄、大豆、小麦、大麦、水稻和玉米。可遗传的VIGS也有望直接应用于农作物改良,生产出不含转基因成分的基因改良作物,迄今为止,采用VIGS鉴定植物基因功能的探索已超过10年的时间。随着载体和方法上的继续进步,我们相信VIGS必将在这个基因组时代发挥更重要的作用。

  参考文献:

  1. Kasajima, Ichiro & Ito, Makoto & Yamagishi, Noriko & Yoshikawa, Nobuyuki. (2017). Apple Latent Spherical Virus (ALSV) Vector as a Tool for Reverse Genetic Studies and Non-transgenic Breeding of a Variety of Crops. 10.1007/978-3-319-55520-1_25.

  2. 孙威, 许奕, 许桂莺,等. 病毒诱导的基因沉默及其在植物研究中的应用[J]. 生物技术通报, 2015, 31(010):105-110.


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